Kad šūnas ir atdalītas, pievienojiet 2 tilpumus iepriekš uzsildītas pilnīgas augšanas barotnes, lai inaktivētu tripsīnu. Uzmanīgi izkliedējiet barotni, vairākas reizes ar pipeti velkot pa šūnu slāņa virsmu, lai nodrošinātu >95% šūnu atgūšanu.
Kā pārtraukt tripsīna darbību?
Tripsīna gremošanu var apturēt, sasaldējot vai pazeminot reakcijas pH zem pH 4, pievienojot skudrskābi, etiķskābi vai trifluoretiķskābi (tripsīns atgūs aktivitāti, kad pH ir paaugstināts virs pH 4). Sagremotos paraugus var uzglabāt -20°C.
Kas neitralizē tripsīnu?
Buferis satur kalcija un magnija jonus arī palēninās tripsīna darbību. Tomēr FBS ir efektīvāks veids, kā inhibēt tripsīna aktivitāti.
Vai serums inaktivē tripsīnu?
Serums inaktivē tripsīna atlikumu, kas paliekno nieru fermentatīvās gremošanas, un proteolītiskos enzīmus, ko pēc tam sintezē šūnas. Svaigi tripsinizētas šūnas var izaudzēt līdz vienslāņiem bez seruma ar nosacījumu, ka tās tika atkārtoti mazgātas, lai noņemtu tripsīna atlikumus.
Cik daudz datu nesēja nepieciešams, lai deaktivizētu tripsīnu?
Kamēr kopā ar tripsīnu izmantojat vismaz 1:1 5-10% serumu saturošu barotni, ir jābūt vairāk nekā pietiekamai inhibīcijai, kam seko centrifugēšana. un vidēja apmaiņa ar svaigu barotni.